Первым настоятелем обители стал преподобный Афанасий старший. Еще в Свято-Троицкой обители преподобного Сергия Афанасий стяжал себе славу ученого мужа и книгописца, много трудившегося для возрождения утраченной на Руси за годы татарского пленения преемственности византийской духовной традиции. Благодаря таким же трудам подвижника в Высоцком монастыре обитель приобрела значение центра византизма на Руси. В 1374 г. первопострижеником монастыря стал преподобный Никон Радонежский.
8 сентября 1380 г. на Куликовом поле русское воинство одержало великую победу над Золотой Ордой. Исход сражения решил Засадный полк, которым командовал Серпуховский князь Владимир Андреевич, В стенах Высоцкой обители благоверный князь захоронил останки воинов-серпуховичей, над братской могилой которых в память о великой победе был воздвигнут белокаменный собор в честь Зачатия святой праведной Анной Пресвятой Богородицы, освященный вместе с построенной Митрополитом Киприаном в 1381 г. трапезной церковью.
В 1387 г. для составления «Ока церковного» — единого Устава Русской Церкви по благословению преподобного Сергия преподобный Афанасий отбыл в Царьград, где, завершив свой труд, в 1401 г. скончался.
Вторым святым игуменом Высоцкого монастыря стал преподобный Афанасий младший. При нем монастырь продолжал процветать, сохраняя благословленные преподобными Сергием и Афанасием традиции и иноческий уклад жизни. Афанасий младший также пребывал в аскетическом подвиге и почитался как чудотворец. Преставился он в возрасте 33 лет. С самого момента погребения преподобный Афанасий прославился чудесами. В 1571 г. во время нашествия агарян в образе грозного всадника с большим жезлом на белом коне он явил свое заступничество городу и родной обители. С тех пор преподобный Афанасий младший почитается как небесный покровитель Серпухова.
По смерти преподобного Афанасия младшего в 1395 г. настоятельство обители перешло к преподобному Никите, сроднику и ученику преподобного Сергия, успешно управлявшему монастырем в течение девятнадцати лет. В 1414 г. он перешел в Боровский Высоко-Покровский монастырь, где в послушании у него семь лет пребывал преподобный Пафнутий Боровский. Около 1421 г. преподобный Никита отправился на север, и в 1426 г. в Костроме основал Богоявленский монастырь, где и обрел место последнего упокоения.
Время управления монастырем первыми тремя настоятелями, прославленными в сонме Радонежских святых, преподобными Афанасием старшим, Афанасием младшим и Никитой, составило его святое сорокалетие и вошло в историю древней Высоцкой обители как самая драгоценная страница.
В дальнейшем история монастыря тесно связана с городом Серпуховым. Являясь южной оборонительной границей Московского княжества, город часто подвергался нападениям со стороны внешних врагов. Под Сер-пуховым устраивались сборы войск, и Высоцкая обитель нередко посещалась знатью и самим царем. Для таких случаев в монастыре имелись особые «царские палаты». В XVI в. в обители были построены Никольский и Сергиевский храмы, придел в честь Рождества Богородицы и галерея вокруг собора.
Весной 1571 г. к Серпухову подошли отряды хана Девлет-Гирея. Не подготовленный к нападению, царь Иван Грозный спешно бежал со своими опричниками из города. Татары пожгли и разорили город и всю округу, осквернили храмы. Монастырь на Высоком также был разграблен и предан огню. Много бедствий обитель претерпела и в Смутное время.
Годы правления царей Михаила Федоровича и Алексея Михайловича стали для Высоцкого монастыря порой возрождения. Возобновилось поступление в обитель щедрых пожертвований. Наиболее значительные вклады были сделаны представителями рода Нарышкиных и особенно царицей Натальей Кирилловной, матерью императора Петра I. К концу XVII в. на средства вкладчиков многие храмы и иконостасы обновились. В 1770-е гг. вместо старой деревянной ограды вокруг монастыря были воздвигнуты каменные стены с четырьмя угловыми башнями.
К середине XVIII в. Высоцкий монастырь процветал, в его владении находились значительные земельные угодья, действовало семь каменных церквей и величественный собор, имелись богатейшая ризница и большая библиотека. По Указу 1764 г. о секуляризации церковных владений монастырь лишился своих вотчин и перешел на государственное содержание по штату.
С начала XIX в. благосостояние обители вновь стало расти. Около 1840 г. была сооружена трехъярусная колокольня, во втором ярусе которой расположился Трехсвятительский храм. Освящение этой церкви в 1843 г. совершил святитель Филарет, митрополит Московский.
В 1872 г. расширили Покровскую церковь-трапезную за счет пристройки с северной стороны придела в честь Похвалы Пресвятой Богородицы, а 1878 г. воздвигли величественный храм во имя преподобных Афанасия Афонского и Сергия Радонежского (разрушен в 1967 г.). В 1896 г, на средства фабриканта Н.Н.Коншина по проекту известного русского архитектора Р.И.Клейна был построен в византийском стиле храм во имя Всех святых с семейной усыпальницей храмоздателя в нижнем этаже.
К началу XX в. Высоцкий монастырь, по отзывам современников, представлял собой одну из самых благоустроенных обителей Отечества.
В 1928 г. власти закрыли монастырь. Только Покровский храм продолжал действовать в качестве приходской церкви. В 1931 г. монастырь полностью прекратил свою деятельность.
25 марта 1991 г. Священный Синод Русской Православной Церкви принял решение об открытии и возрождении Серпуховского Высоцкого мужского монастыря. Начались восстановительно-реставрационные работы.
24 сентября 1994 г. состоялось обретение святых мощей преподобного Афанасия Высоцкого младшего. В день 600-летия со дня его преставления, 25 сентября 1995 г., монастырь посетил Святейший Патриарх Алексий П.
В 2002 г. совершилось Великое освящение главного храма обители — Зачатьевского собора. 18 мая 2003 г. обитель торжественно отметила 125-летие явления чудотворного образа Божией Матери «Неупиваемая Чаша», почитание которого было возобновлено по открытии монастыря. Воссозданный первообраз находится в Покровском храме.
Сегодня в монастыре действуют шесть храмов: Покровский, Никольский, Зачатьевский, Сергиевский, во имя Трех святителей и в честь иконы Божией Матери «Скоропослушница», еще в трех продолжаются реставрационные работы и создаются два новых.
В монастыре собрано множество святынь, благоговейно почитаемых верующими, в том числе около трехсот частиц мощей угодников Божиих. Особое место занимает чудотворный образ Божией Матери «Неупиваемая Чаша», в который вставлен ковчежец с частицей пояса Пресвятой Богородицы. Образ прославлен многими чудесами и исцелениями, в основном, от страстей винопития, наркомании и табакокурения. В том же храме почивают святые мощи преподобного Афанасия Высоцкого младшего.
В монастыре ежедневно совершается полный круг богослужений с обязательным по окончании Литургии водосвятным молебном перед чудотворным образом Божией Матери «Неупиваемая Чаша».
