Никольский храм, посвященный небесному покровителю города Серпухова Святителю Николаю, расположен с южной стороны Зачатьевского собора, на месте, где при основании обители был водружен Крест и воздвигнута первая деревянная церковь. Над храмом, на втором этаже здания расположена соборная ризница, над ней - церковь во имя Преподобного Сергия. Основанный в XVI веке, Никольский храм служил для совершения заупокойных богослужений по ктиторам обители, в числе которых был и род Нарышкиных. Последняя реставрация храма была произведена в 1873 году на средства г. Шибаевых. К этому времени относится и сохранившаяся масляная живопись, изображающая жизнь и чудеса Святителя Христова Николая.

Ко времени открытия монастыря в храме располагалась пилорама. Он был настолько обезображен, что трудно было догадаться, что когда-то здесь был храм. Но в 1991 г.

Это был единственный храм, который возможно было приготовить к зиме для совершения богослужений. Наскоро были произведены необходимые работы,расчищена замазанная известью живопись, из старых икон, пожертвованных монастырю, собран иконостас.

11 августа 1991 года, в день Рождества Свт. и Чудотворца Николая, Преосвященным Епископом Можайским Григорием было совершено великое освящение храма. В 1996 году в храм проведено отопление. Зимой 1997 года начат его капитальный ремонт: заново оштукатурены стены храма, отреставрирована живопись 1873 года, а утраченная часть написана вновь. 18 июня 1997 года совершилось его малое освящение. Невысокий сводчатый Никольский храм невелик, но по-домашнему уютен.